Cours de Génétique |
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cours rédigé par M. Silar
Cours
rédigé par Mme Gonzy
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Le principe de la mutagenèse La
méthodologie génétique est une approche très performante pour étudier le
fonctionnement des systèmes biologiques (gènes et protéines, réseaux de gènes
et mécanismes pluri-moléculaires, cellulaires ou agissant au niveau de
l'organisme). La
démarche suivie consiste dans un premier temps à obtenir des mutants qui ont
des défauts dans l'objet ou le processus que l'on étudie. Il faut ensuite
caractériser les mutations par les méthodes de la génétique classique.
Ensuite, les gènes ainsi identifiés et qui interviennent dans le processus
sont clonés par des démarches de génétique moléculaire (clonage positionnel
ou par expression fonctionnelle). Leur caractérisation fait appel aux
méthodes de la biochimie et biologie moléculaire, de la génétique
des interactions et de la génétique inverse. La génétique inverse
consiste dans l'obtention in vitro de mutations spécifiques dans un
gène et la réintroduction de celui-ci par transformation ou transfection dans
un organisme, les effets obtenus sont ensuite analysés:
La mutagenèse classique La
mutagenèse classique permet produire toute une palette de mutations ayant des
effets divers sur les gènes allant de leur inactivation jusqu'à leur
dérégulation en passant par des modifications du fonctionnement des protéines
qu'ils codent. Elle se passe en deux étapes: - l'application du
traitement mutagène L'application du traitement
mutagène Même si
celui-ci n'est pas obligatoire, le faible taux des mutations spontanées
entraîne dans la grande majorité des cas, l'utilisation obligée d'un
traitement mutagène. Ce traitement va dicter en fonction de sa spécificité le
type de mutations qui vont être obtenues, je vous renvoie au chapitre 3. De
même, le traitement mutagène va moduler le type de clonage qui pourra être
effectué par la suite. Actuellement, deux grands types de mutagènes sont
utilisés: - la mutagenèse classique aux UV ou
avec des produits chimiques mutagènes. D'un point de vue de la sécurité, les
UV sont préférables en particulier depuis que du matériel facile
d'utilisation et parfaitement sécurisé est disponible. Cependant, le spectre
des mutations obtenues avec les UV ne permet pas toujours d'obtenir ce que
l'on désire. De même, certains organismes sont très résistants aux
traitements avec des UV. Les mutagènes chimiques sont alors utilisés. Il
existe alors des conditions draconiennes d'utilisation de ces produits qui se
fait dans des pièces sécurisées. Pour
que ce traitement soit efficace, il faut que de nombreuses mutations soit produites. Les mutations apparaissant au hasard dans
le génome, beaucoup d'entre elles vont toucher des gènes essentiels et donc
après le traitement le taux de survie va être fortement diminué. En pratique, il faut donc partir d'un
effectif suffisamment grand pour tenir compte de cette létalité.
Réciproquement, le taux de survie est une indication de l'efficacité du
traitement mutagène. Classiquement, un taux de survie de 1 à 5% est
indicatif que le traitement a bien fonctionné et que de nombreuses mutations
ont été produites. Les
mutations obtenues avec ce type de traitement sont le plus souvent
ponctuelles (il est aussi possible d'obtenir avec certains produits des
délétions). Elles peuvent inactiver le gène, modifier son fonctionnement voir
augmenter son fonctionnement. Ce type de mutagenèse permet donc d'obtenir des
mutations qui ont un large éventail d'effets. - la mutagenèse insertionnelle par
transposition ou par transformation (le REMI). Vous
verrez avec Madame Gonzy-Treboul, l'utilisation des
transposons pour la mutagenèse. Le REMI se base sur les propriétés de
l'intégration de l'ADN exogène introduit dans des cellules après
transformation. Il est bien évident que ces évènements d'intégration sont
sélectionnés grâce à la présence sur l'ADN introduit d'un marqueur de
sélection (gène de résistance à un antibiotique, marqueur d'auxotrophie ...). Chez
la majorité des organismes, l'ADN transformé recombine par un processus de
recombinaison non homologue, c'est à dire ne faisant pas appel à la présence
de séquence homologues : Ces morceaux d'ADN en
s'insérant vont inactiver ou modifier l'expression de gènes. Le plus souvent
le processus d'intégration est complexe et modifie profondément la structure
de l'ADN qui s'insère (insertion de plusieurs copies du fragment d'ADN) et
celle de l'ADN situé au point de jonction (délétion ou duplication de la
séquence d'insertion). Des chercheurs ont constaté chez certains organismes
que si l'ADN est préalablement linéarisé par un enzyme de restriction et que
l'enzyme de restriction est aussi ajouté dans le mélange de transformation,
alors l'intégration se produit proprement (une seule copie de l'ADN est
intégrée et l'insertion se fait sans délétion ou duplication à une séquence
qui correspond à un site de restriction de l'enzyme utilisé. Exemple en
utilisant BamHI Ce type de mutagenèse
génère donc des mutants d'insertion qui, le plus souvent, sont des allèles
nuls ou ayant une expression modifiée. Le spectre est donc plus réduit que la
mutagenèse classique. Mais elle permet de cloner rapidement les gènes ainsi
identifiés, car grâce à la PCR, il existe maintenant de techniques efficaces
(que vous verrez en Biologie Moléculaire) pour isoler les fragments d'ADN
bordant le point d'insertion si on connaît la séquence du plasmide utilisé. la sélection des mutants Le but des expériences de mutagenèse est d'obtenir des mutants qui ont
un phénotype voulu afin d'étudier certains processus. Comme ces expériences
sont souvent lourdes et dangereuses, il est important de minimiser au maximum
l'expérimentation. Ceci passe donc par la mise au point de systèmes
astucieux permettant de récupérer les mutants d'intérêt. Il faut donc
mettre au point ce que l'on appelle un crible
de sélection. Ce crible de sélection peut permettre de récupérer directement les
mutants d'intérêt. Ce sont des cribles de
sélection dit positifs. Exemple Afin de connaître la cible moléculaire d'un antibiotique, il est
possible de rechercher deux types de mutants : des mutants résistants à
l'antibiotique ou des mutants encore plus sensibles que les cellules sauvages
(mutants hypersensibles). Pour rechercher les mutants résistants, il existe un crible positif
très simple. Il suffit d'étaler les cellules à la sortie du traitement
mutagène sur du milieu contenant l'antibiotique. "Tout ce qui
pousse" est bon ! Par contre, dans le cas réciproque où l'on recherche des mutants qui
sont plus sensibles que la souche de départ il faut impérativement à la
sortie du traitement mutagène étaler les cellules sur du milieu sans
antibiotique et ensuite repiquer sur du milieu avec antibiotique. Les
cellules qui poussent sur le premier milieu mais pas sur le suivant sont les
bonnes (on a affaire à un crible de sélection négatif). Il est évident que ce type de crible est beaucoup plus lourd et
consommateur en matériel ! Une fois que les mutants sont obtenus, il faut les analyser
génétiquement afin de: - s'assurer que le phénotype est bien la résultante d'une seule
mutation. Pour ceci, il faut analyser la ségrégation des mutations. Pour ceci
voir le chapitre 5. - répartir les mutations dans les différents gènes identifiés. Pour
ceci, le généticien dispose de deux outils principaux, la complémentation et
la cartographie. 3 exemples de sélection de mutants Pour vous
familiariser avec les techniques de mutagenèse, voici 3 exemples; 1- La sélection de mutations de la chaîne respiratoire chez la levure
Saccharomyces cerevisiae La levure Saccharomyces
cerevisiae est un aréobe facultatif, c'est à
dire qu'elle peut fermenter en absence de source de carbone respirable. Sa
croissance peut donc se faire par fermentation en absence d'oxygène ou par la
fermentation suivie de la respiration en présence d'oxygène. Il est possible
de lui fournir des sources d'énergie non fermentable et donc uniquement
utilisable par la respiration (glycérol ou lactate). Ce système est donc
idéal pour sélectionner des mutants affectant la respiration et ainsi de
décortiquer le système respiratoire. La recherche de mutants incapables de
respirer se fait en recherchant après traitement mutagène des souches qui
pousse sur un milieu fermentable (milieu contenant du glucose) mais qui ne
pousse pas sur milieu uniquement respirable (milieu contenant du glycérol ou
du lactate). Ce crible est donc un crible négatif. Il conduit à l'isolement
de mutants ayant acquis une mutation soit de l'ADN mitochondrial (mutant rho-
ou mit-) ou de l'ADN nucléaire (mutant pet-). D'autres cribles permettent
d'obtenir des mutants plus spécifiques : C'est en utilisant
le crible ci-dessus en utilisant du lactate qu'ont été récupérés des mutants
dans le gène codant le cytochrome C (qui est un intermédiaire du transport
des électrons dans la chaîne respiratoire). En fait, la levure possède 2
gènes qui codent pour le cytochrome C. L'un assure 95% de la production de
cytochrome C (iso1) l'autre 5% (iso2). On s'est aperçu par hasard qu'un
mutant déficient dans la production iso1 peut respirer en utilisant du
glycérol comme source de carbone mais pas du lactate (il est probable que la
respiration du glycérol nécessite moins de cytochrome C que celle du lactate
et que les 5% iso2 suffisent pour permettre la respiration). Ceci n'est pas
le cas de la majorité des mutants affectés dans la chaîne respiratoire. Il
est donc possible de récupérer assez spécifiquement des mutants de l'iso1 en
sélectionnant par réplique des souches qui respirent sur glycérol mais pas
sur lactate. C'est toujours un crible négatif. Un autre crible disponible est
l'utilisation de benzidine qui colore en bleu foncé les hémoprotéines. La
coloration est plus sensible aux variations de la quantité de cytochrome C
qu'à celles des autres cytochromes. Pour chercher des mutants déficients en
cytochrome C, il suffit donc de rechercher des colonies bleu clair parmi les
sauvages qui sont bleu foncé. Il s'agit donc là d'un crible positif. 2- La sélection de drosophiles femelle-stériles L'obtention
de mutants de drosophile femelle-stériles permet d'identifier des gènes qui
interviennent dans la fabrication des ovocytes. Plusieurs gènes sont
probablement impliqués. Certains localisés sur le chromosome X et d'autres
sur les autosomes. Nous allons voir un crible qui permet d'identifier des
gènes sur le chromosome X. L'utilisation de drosophiles pendant la mutagenèse
est délicate. En effet, le traitement mutagène affecte la lignée germinale
des mouches traitées et la révélation de l'effet mutagène se fait sur les
générations suivantes. Les mouches doivent être traitées individuellement
afin de les différencier et d'obtenir des allèles mutants indépendants.
De même, la biologie des mouches (où des
fécondations multiples se produisent) fait que l'on doit s'assurer dès le
départ de l'expérience que les mouches femelles utilisées sont vierges, afin
d'obtenir des résultats interprétables ! Dans le cas de mouches stériles, il
faut aussi faire des stocks d'entretien facile afin de conserver les
mutations (en particulier des mutations de stérilité femelle dominante ne
pourront être conservées à l'aide de mouches femelle !). Les généticiens de
drosophile ont donc mis au point une armada d'outils pratiques pour effectuer
des mutagenèses dans de bonnes conditions. Le
traitement mutagène a été effectué sur des mâles à l'aide de l'EMS (éthyle
méthyle sulfonate). Ils portaient un allèle
vermillon qui donne une couleur rouge vive aux yeux et qui est facilement
détectable. Ces mâles ont ensuite initié la série de croisements suivants : 3- la sélection de mutations qui affectent la régulation par la lumière
bleue chez Neurospora crassa Parfois,
le criblage de mutations passe par la construction d'outils appropriés.
Examinons plus en détail un exemple très élégant chez Neurospora crassa. Ce
champignon filamenteux présente un rythme circadien de la production de
conidies (voir film Rythme circadien de
Neurospora). Ce rythme est contrôlé par la lumière dans la zone du
spectre qui est bleu. Des gènes régulés par la lumière bleue ont été isolés
et deux gènes de régulation ont été identifiés (wc-1 et wc-2).
Il semblait aux expérimentateurs que plusieurs gènes de régulation devaient
encore être identifiés. Pour ceci le système suivant a été mis au point : - Le
promoteur du gène al-3 qui est régulé par la lumière a été fusionné à
la séquence codante du gène mtr. Ce gène
code une perméase qui permet l'entrée de certains acides aminés dont le
tryptophane et la phénylalanine. - Une
souche mtr- et trp- est
transformée avec cette construction. Les transformants obtenus peuvent
pousser sur du milieu + tryptophane que si le champignon est éclairé ! Ce système
fourni deux cribles de sélection : - il est possible de cribler des
mutants qui poussent sur milieu + tryptophane dans le noir. Ces mutants ont
une expression constitutive à partir du promoteur al-3. Avec ce
système, il est donc facile d'obtenir des mutations dans des répresseurs de al-3. C'est ainsi qu'a été obtenu le gène ccb-1
qui semble être un répresseur de certains gènes régulés par la lumière. - Il existe un analogue toxique de la
phénylalanine, la p-fluorophenylalanine qui entre
dans la cellule via mtr. La croissance des
transformants est donc inhibée à la lumière si l'on met de la p-fluorophenylalanine dans le milieu. Ceci donne un
deuxième moyen de sélection. Il suffit de sélectionner des mutants qui
poussent dans ces conditions. Ceux-ci n'expriment plus mtr
à partir du promoteur al-3. Il est de plus possible de faire varier la
quantité de p-fluorophenylalanine, ce qui permet
d'obtenir des mutants ayant des effets plus ou moins importants. Les cibles
des mutations dans ce cas sont donc des activateurs d'al-3. Comme
prévu, les gènes wc-1 et wc-2 ont été retrouvés en utilisant ce
crible et c'est ainsi qu'ont été identifiés deux nouveaux gènes blr-1
et blr-2. Ces deux gènes ont des effets moins importants que wc-1
et wc-2 qui semblent être les seuls gènes dont les mutations rendent
les souches complètement aveugles à la lumière bleue. Ce système
a donc permis de sélectionner des nouveaux gènes qui ont une influence plus
subtile sur la régulation par la lumière bleue. La technologie de l'ADN recombinant et la mutagenèse dirigée Maintenant,
il est possible de créer artificiellement in vitro des mutations dans une
séquence d'ADN et donc de choisir éventuellement leurs effets. Plusieurs
techniques sont disponibles. Nous verrons seulement quelques-unes d'entre
elles. La démarche est la suivante:
La
première étape relève de votre cours de biologie moléculaire. La deuxième étape dépend de
l'organisme. A l'heure actuelle, des techniques de transformation sont
développées pour la grande majorité des organismes. Plusieurs procédures sont
disponibles : (1)
traitement de la paroi qui permet soit de révéler des transporteurs qui
assurent l'entrée de l'ADN à l'intérieur de la cellule soit de perturber la
membrane cellulaire et de faciliter ainsi l'entrée de l'ADN. Ce sont les
techniques utilisées pour les bactéries (traitement au CaCl2 ou
DMSO), les levures (Traitement au LiCl ou enzymes
lysant la paroi), les champignons (enzymes lysant la paroi) ou les cellules
en cultures (phosphate de calcium). (2)
traitement plus direct tel que l'injection à l'aide d'une aiguille (œuf de
vertébrés, drosophile, C. elegans) ou par
tir de billes recouvertes de l'ADN à l'aide d'un canon à ADN (plantes,
mitochondries de levure). (3)
utilisation de systèmes d'introduction spécifiques tels que l'emploi d'Agrobacterium chez les plantes (cette bactérie
contient un plasmide, le plasmide T-DNA qui est injecté
dans les cellules de plantes où il s'intègre au génome. Evidemment, tout
fragment d'ADN cloné dans ce plasmide sera co-intégré). La
troisième étape peut se faire de multiples manières en fonction de la
modification voulue, utilisation de la PCR ou du Southern
blot pour vérifier la structure de l'ADN introduit, Northern
Blot et Western blot pour mesurer l'expression, etc. Comment sur-exprimer un gène On connaît deux méthodes pour sur-exprimer un gène. (1) il est possible d'introduire par transformation plusieurs copies du
gène. La méthode la plus sure est de le mettre sur un plasmide multicopie mais ceci n'est possible que chez le nombre
limité d'organismes où l'on dispose d'un tel outil (bactérie, levure). La
seconde méthode consiste à transformer les cellules avec des quantités
importantes d'ADN. Chez certains organismes comme C. elegans,
cela aboutit à l'intégration en tandem de plusieurs copies de cet ADN
permettant ainsi en théorie la sur-expression. Je
vous rappelle cependant qu'il n'y a pas toujours de relation entre le nombre
de copie et l'expression à cause de processus de régulation et qu'en
particulier chez certains organismes, on constate une inactivation des gènes
en plusieurs exemplaires par méthylation ou PTGS. (2) s'il s'agit d'un gène codant pour une protéine, il est possible de
cloner la séquence codante du gène dans une cassette d'expression forte. Cette cassette est constituée d'un fragment d'ADN comprenant un
promoteur fort (provenant d'un gène dont le produit intervient dans la
glycolyse, gène d'actine ou du facteur d'élongation de la traduction eEF1A)
et d'un fragment d'ADN provenant d'une région terminateur de gène. Pour ce genre d'expérience, il n'est pas nécessaire d'inactiver le(s)
gène(s) déjà présents. Pour s'assurer de la sur-expression
du produit, il faut regarder le niveau d'expression de la protéine dans des
extraits de protéines totales (il est par exemple possible de révéler dans
certains cas par un traitement immunologique). Ce type d'expérience permet
d'apporter des éléments sur la fonctionnalité de la protéine. exemple: Chez C. elegans, il existe deux types de vers qui ont un
comportement soit solitaire soit grégaire. La différence est liée à la
présence dans les populations d'un gène polymorphe présentant deux allèles.
Ce gène npr-1 code pour un produit qui ressemble à un récepteur de
neuropeptides. L'allèle solitaire est dominant sur l'allèle grégaire.
L'analyse moléculaire des deux allèles montre qu'ils sont tous les deux
fonctionnels. L'hypothèse faite est donc que le produit de l'allèle grégaire
fonctionne moins bien que celui de l'allèle solitaire. Pour tester ceci, des
œufs de la souche grégaire ont été injectés par différentes quantités d'ADN
contenant les allèles grégaires ou solitaires. Alors qu'avec l'allèle
solitaire toutes les quantités testées donnent des souches transformées avec un
comportement solitaire, dans le cas de l'allèle grégaire les seules les
souches issues du traitement avec la quantité la plus importante ont un
comportement solitaire. Cela montre qu'effectivement l'allèle grégaire code
probablement pour une protéine moins fonctionnelle que celle codée par
l'allèle solitaire. Comment inactiver un gène Actuellement, il existe de nombreuses techniques pour inactiver des
gènes et ainsi obtenir des allèles nuls. La technologie utilisée dépend de
l'organisme et de ses propriétés biologiques. Nous prendrons deux exemples, la levure car c'est l'organisme pour
lequel cette inactivation de gène est la plus
simple et Caenorhabditis elegans pour lequel il existe un phénomène
d'extinction épigénétique, le RNAi. - La levure La première étape consiste dans le remplacement in vitro de tout
ou partie du gène porté par un plasmide bactérien par un marqueur de
sélection (prenons par exemple URA3+). Ceci se fait par les
méthodes de l'ADN recombinant.
Notez que pour plus de clarté, le dessin est schématisé en utilisant
une souche haploïde. Cependant, l'inactivation d'un gène peut être létale
ou inhiber sévèrement la croissance des souches. Dans ces conditions, il est
impossible de récupérer la souche ayant le gène inactivé. Il faut donc en
fait partir d'une souche diploïde homozygote pour ura3-. Après transformation
avec l'ADN linéarisé, une seule des deux copies est inactivée. On récupère
une souche qui a le génotype suivant :
D/ URA3+ indique l'allèle inactivé et + l'allèle sauvage du gène. Il faut ensuite faire sporuler le diploïde. On obtient ainsi en
théorie: deux spores {D/ URA3+, ura3-}qui
sont prototrophes pour l'uracile et deux spores {+,
ura3-} qui sont auxotrophes pour l'uracile. La présence de spore ura+ dans la
descendance montre que le gène est non-essentiel ! - Caenorhabditis elegans Chez cet organisme, comme chez une vaste majorité des eucaryotes (des
phénomènes identiques ont été observés chez les vertébrés, les plantes,
certains champignons, et des protistes divers !), il a été récemment observé
que l'injection d'ARN doubles brins correspondant à un gène aboutit à
l'extinction de l'expression de ce gène ! Ce phénomène est systémique, c'est
à dire que l'injection dans quelques cellules permet l'extinction du gène
dans l'ensemble des cellules ! (il est possible pour procéder de nourrir les
vers avec des bactéries produisant les ARN doubles brins, cela entraîne
l'extinction !). Cette extinction peut même se transmettre sur une ou deux
générations (il devient alors un phénomène épigénétique)
! On parle pour ce mécanisme de RNAi
pour RNA interferences. Des études sont menées actuellement pour élucider les mécanismes mis en
jeu. Ce que l'on sait, c'est qu'à la suite de l'injection les ARN doubles
brins sont retrouvés sous forme de petits morceaux d'une vingtaine de paires
de bases qui semblent activer une RNAse. Celle-ci
gagne sa spécificité probablement grâce aux ARN. Il existe certainement un
mécanisme d'amplification du nombre de ces petits ARN. En particulier, une
RNA polymérase RNA-dépendante est essentielle pour que ce processus agisse.
Voici le modèle actuel : Notez que certains transgènes introduits peuvent produire des ARN
aberrants qui vont provoquer le RNAi. Ceci est
étudié principalement chez les plantes. On parle alors de PTGS. |
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