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Cours de Génétique

 

cours rédigé par M. Silar

 

Chapitre1: rappels

Chapitre2 : un peu d'histoire

Chapitre3 : la variation

Chapitre4 : quelques notions de Génomique

Chapitre5 : la mutagenèse

Chapitre6 : la complémentation

Chapitre7 : la recombinaison et l'établissement de cartes génétiques

Annexes : la ségrégation des gènes au cours des générations dans les différents organismes

Cours rédigé par Mme Gonzy

Chapitre 8 :les mécanismes de recombinaison

 

Chapitre9 : la réparation des dommages à l'ADN

 

Chapitre10 : les éléments mobiles

 

Chapitre 11: la réalisation du phénotype

 

Chapitre 12 : Les interactions géniques

 

 

Principe du test de complémentation

 

A l'issue d'une mutagenèse, on dispose d'une collection d'allèles mutants. En général, ces allèles confèrent le même phénotype. La question se pose alors de savoir combien de gènes sont mis en jeu pour obtenir cette collection d'allèles. La génétique a développé des méthodes qui permettent de répondre à cette question. Il existe deux méthodes: la complémentation et la cartographie. Nous allons commencer dans ce chapitre par le test de complémentation. C'est en effet le plus rapide à mettre en oeuvre et son application permet d'avoir une bonne idée du nombre de gènes.

Le test consiste dans la fabrication d'une souche pour laquelle les allèles mutants sont associés deux à deux en configuration trans et en l'observation du phénotype.

Soit pour un couple d'allèles mutants a et b.

Si les deux allèles sont allèles d'un même gène, cela aboutit au schéma suivant :

Image65

Dans ces conditions, aucun allèle sauvage est présent dans la souche et l'on peut raisonnablement suspecter que le phénotype de la souche sera mutant.

Si les deux allèles sont des allèles de gènes différents, cela aboutit au schéma suivant :

Image66

Dans ces conditions, on voit qu'il y a présence d'allèles sauvages pour chacun des gènes. Donc, si les allèles mutants a et b sont récessifs vis à vis de leurs allèles sauvages respectifs, on peut cette fois raisonnablement suspecter que la souche sera de phénotype sauvage. Notez que ce test ne s'applique donc pas si les mutations sont dominantes.

Le principe du test est donc le suivant. On fabrique les souches avec toutes les combinaisons d'allèles mutants obtenus après mutagenèse, associés deux à deux. Si pour une combinaison le phénotype de la souche obtenue est mutant, on dit que les deux allèles ne complémentent pas et qu'ils sont probablement allèles d'un même gène. Si le phénotype de la souche obtenue est sauvage, on dit alors que les deux allèles complémentent et qu'ils sont probablement allèles de deux gènes différents. A l'aide de ceci, on construit un tableau. Il reste ensuite à déterminer le nombre de gènes.

exemple : pris dans mon laboratoire !

Nous avons obtenu après mutagenèse 6 souches du champignon Podospora anserina portant chacune un allèle mutant indépendant. Ces 6 souches ne différencient pas d'organes femelles (périthèces). Nous avons associé dans des hétérocaryons les six allèles deux à deux et avons obtenu les résultats suivants :

m1

m2

m3

m4

m5

m6

m1

-

+

+

+

-

-

m2

-

-

+

+

+

m3

-

+

+

+

m4

-

+

+

m5

-

-

m6

-

 

Le signe - indique que l'hétérocaryon avec mi dans un noyau et mj dans l'autre ne différencie pas de périthèce (phénotype mutant). Le signe + indique qu'il en différencie (phénotype sauvage).

De ce tableau nous pouvons tirer que :

- l'allèle m4 complémente avec tous les autres et donc qu'il caractérise un gène.
- les allèles m1, m5 et m6 ne complémentent pas entre eux mais complémentent avec tous les autres et donc qu'ils caractérisent un deuxième gène
- les allèles m2 et m3 ne complémentent pas entre eux mais complémentent avec tous les autres et donc qu'ils caractérisent un troisième gène.

Au total, trois groupes de complémentation. Il semble donc y avoir trois gènes qui ont pu être identifiés par cette méthode.

 

 

Conditions d'application

 

L'application du test se fait différemment en fonction du type d'organisme. En effet, la construction des souches est simple si on est chez un organisme diplobiontique ou haplodiplobiontique. Il suffit dans ce cas de croiser des parents purs pour chacun des allèles mutants et d'observer la F1 ou les diploïdes produits.

Chez les organismes haplobiontique (comme P. anserina) ou dans les cellules en culture, il est souvent impossible de fabriquer des noyaux diploïdes. On a donc recourt à la fabrication d'hétérocaryons. Mais ceci est plus aléatoire. En effet, dans un noyau diploïde, les allèles sont certainement présents à l'état "hétérozygotes" avec un nombre fixe de copies. Chez les hétérocaryons, le rapport des noyaux peut varier, voire à l'extrême un des deux types de noyau peut se perdre. La construction d'hétérocaryons dit balancés peut compenser ceci. Un des noyaux possède un marqueur d'auxotrophie ou de résistance à un antibiotique. L'autre possède un autre marqueur d'auxotrophie ou une autre résistance.

 

exemple:

Chez P. anserina, on dispose d'une souche leu1-1 qui est auxotrophe pour la leucine et d'une souche lys2-1 qui est auxotrophe pour la lysine. On sait que si l'on forme un hétérocaryon leu1-1/lys2-1, celui pousse sur milieu minimum (cela veut donc dire que les 2 mutations complémentent et qu'elles affectent des gènes différents, ce que l'on pouvait présager !).

Image68

 

Ceci permet donc de conserver les deux types de noyaux. Si l'on veut tester la complémentation de deux mutations m1 et m2, il suffit de construire l'hétérocaryon (leu1-1, m1)/(lys2-1, m2) et de le faire pousser sur milieu minimum. Celui-ci conservera les noyaux avec m1 et ceux avec m2.

 

Dans certains systèmes génétiques et il est difficile de maintenir les mutations en position trans à cause des recombinaisons. Cela aboutit à la formation de configurations de ce type où les mutations sont en positions cis:

Image69

On réobtient donc dans ce cas un allèle sauvage qui a toutes les chances de conférer un phénotype sauvage et ceci bien que les 2 mutations soient dans le même gène.

exemple:

Dans le génome mitochondrial de levure, la recombinaison est très rapide. Si l'on veut tester la complémentation de mutations mitochondriales affectant la respiration, il faut donc procéder de la manière suivante :

 

mata m1 x mata m2

ê

1 ou 2 heures

mesure de la respiration à l'oxygraphe

 

En effet, le protocole suivant va entraîner la sélection des recombinants sauvages et non pas celle des diploïdes où se produit la complémentation:

 

mata m1 x mata m2

ê

étalement sur milieu uniquement respirable

(milieu contenant du glycérol comme unique source de carbone

ê

observation si croissance

 

Des problèmes similaires peuvent se rencontrer dans le cas de l'étude des mutations dans des phages ou des virus.

 

En résumé, il faut pour appliquer le test de complémentation, s'assurer que les mutations sont récessives et qu'elles sont bien présentes et associées en trans.

Les limites du test

 

Si le test de complémentation est un test très puissant, il arrive de rencontrer un certain nombre d'exception. Notez que si des mutations n'ont pas les propriétés attendues dans le test de complémentation, cela apporte des indications sur le fonctionnement des gènes mutants.

 

Des mutations localisées dans le même gène mais qui complémentent !

Il arrive que des mutations localisées dans un même gène complémentent. On parle alors de complémentation intragénique ou interallélique. Deux explications au moins sont possibles pour l'expliquer.

La complémentation est un test qui analyse la fonction. Si un gène produit un polypeptide qui a plusieurs fonctions, alors des mutations affectant chacune des fonctions peuvent complémenter.

exemple:

Chez Neurospora, la synthèse du tryptophane nécessite les étapes suivantes:

Image72

Ces deux étapes sont catalysées par le même polypeptide qui porte les deux activités et qui est codé par le gène trp-3. On connaît deux groupes de mutations qui abolissent chacune des fonctions, et un groupe qui abolit les deux activités. Les premières mutations complémentent entre elles, alors qu'elles ne complémentent avec celles du dernier groupe. Notez que les mutations dans un même groupe ne complémentent pas entre elles !

Dans le cas de protéines homo-multimériques, des mutations qui altèrent la fonctionnalité des multimères peuvent se compenser.

exemple:

Des mutations qui changent la charge peuvent empêcher la formation de multimères et inactiver la protéine:

Image73

 

La mise en présence des deux types de monomères permet de reconstituer un complexe actif:

Image74

 

Des mutations récessives localisées dans des gènes différents mais qui ne complémentent pas !

Pour pouvoir appliquer le test de complémentation, il faut que les produits des gènes testés diffusent et agissent au même endroit. Ceci est surtout valable pour les hétérocaryons. Malheureusement, il n'existe pas pour l'instant à ma connaissance d'exemple de ce type qui soit décortiqué jusqu'au niveau moléculaire.

Dans le cas de protéines hétéro-multimériques, des mutations qui altèrent la fonctionnalité des multimères peuvent avoir des effets coopératifs et ainsi aboutir à un effet supérieur à ceux créés par chacune des mutations.

exemple:

L'actine est codée par le gène ACT1 chez Saccharomyces cerevisiae. Les mutations act1-1 et act1-4 provoquent une thermosensibilité récessive à 27°C (la température permissive est de 25°C). Les protéines codées par les gènes TPM1 et SAC6 interagissent avec le cytosquelette d'actine. Les mutations tmp1- et sac6- causent aussi un phénotype de thermosensibilité récessif. Par contre si on construit les souches diploïdes suivantes on obtient dans un cas un résultat bizarre.

act1-1 TPM1+ / ACT1+ tpm1-

thermorésistant

act1-4 TPM1+ / ACT1+ tpm1- 

thermorésistant

act1-1 SAC6+ / ACT1+ sac6-

thermorésistant

act1-4 SAC6+ / ACT1+ sac6-

THERMOSENSIBLE

Il existe donc un effet spécifique non attendu entre act1-4 et sac6-. Cet effet est retrouvé fréquemment avec des mutations dans act1 et des mutations dans les gènes codant pour les protéines qui interagissent avec le cytosquelette. Deux modèles ont été proposés pour expliquer ce phénomène :

- Le dosage

Image75

 

- Le poison

Image76

 

En fait, les 2 cas peuvent se produire dans le cas du système actine, c.a.d. qu'en fonction des couples de mutations l'un ou l'autre s'applique.

 

 

Le terme de complémentation a été adapté à deux autres situations

 

Par les biochimistes, pour identifier une protéine responsable d'une fonction particulière.

exemple:

Le groupe de Kornberg qui travaillait sur l'initiation de la réplication chez E. coli, disposait de mutants d'initiation de la réplication (dnaB etc.). Il avait aussi un test d'initiation in vitro à partir d'un extrait acellulaire de la souche sauvage. Pour identifier les protéines affectées dans les différents mutants, par exemple dnaB. Ils ont fait un extrait acellulaire de la souche mutante dnaB et ont montré qu'il ne permettait pas la réplication in vitro. Ils ont ensuite fractionné l'extrait acellulaire issue de la souche sauvage et ont ajouté séparément les différentes fractions à leur extrait de dnaB. Ils ont ainsi pu caractériser la fraction qui contenait la protéine dnaBp sur le critère de restauration de l'initiation de la réplication. Des fractionnements successifs de ce type ont ainsi permis de purifier différentes protéines impliquées dans l'initiation de la réplication chez E. coli.

 

Par les généticiens moléculaires, pour le clonage des gènes par expression (qui est un terme plus correct que le terme de clonage par complémentation). Lorsque l'on dispose d'une souche qui n'exprime pas un caractère (parce qu'elle contient un allèle mutant d'un gène ou parce que l'organisme ne possède pas le gène), il est possible de trouver des gènes qui restaurent le caractère. Il faut pour cela fabriquer une banque à partir d'une souche qui présente le caractère et transformer la souche qui ne le possède pas. L'isolement de transformants qui ont le caractère recherché permet de conclure que ceux-ci contiennent un fragment d'ADN qui confère le caractère et donc le gène responsable (attention, il peut aussi s'agir de réversions).

exemple:

Nous avons déjà vu chez la levure ce principe pour les plasmides navette. Voici un autre exemple tiré de mon laboratoire. Nous possédons des souches qui ne différencient plus de périthèces (organes femelles) à cause de la présence d'un allèle mutant d'un gène que pour l'instant nous appelons YPH1. Nous voulions cloner l'allèle sauvage du gène. Pour ceci nous disposions d'une banque de cosmides fabriquée à partir de la souche sauvage. Nous avons transformé la souche mutante YPH1 par les cosmides de cette banque. Nous avons testé la fertilité des transformants et avons trouvé un transformant qui était fertile. Celui-ci avait intégré l'ADN qui contenait l'allèle sauvage du gène. Nous disons que nous avons cloné par expression le gène "YPH1+".

Notez que pour que ce type de clonage marche, il faut que la souche réceptrice porte l'allèle récessif et la banque contiennent l'allèle dominant.

 

 

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