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Cours de Génétique

 

cours rédigé par M. Silar

 

Chapitre1: rappels

Chapitre2 : un peu d'histoire

Chapitre3 : la variation

Chapitre4 : quelques notions de Génomique

Chapitre5 : la mutagenèse

Chapitre6 : la complémentation

Chapitre7 : la recombinaison et l'établissement de cartes génétiques

Annexes : la ségrégation des gènes au cours des générations dans les différents organismes

Cours rédigé par Mme Gonzy

Chapitre 8 :les mécanismes de recombinaison

 

Chapitre9 : la réparation des dommages à l'ADN

 

Chapitre10 : les éléments mobiles

 

Chapitre 11: la réalisation du phénotype

 

Chapitre 12 : Les interactions géniques

 

 

Utilité des cartes génétiques

 

La cartographie permet de positionner des gènes sur les chromosomes. A l'issue de mutagenèse, cette méthode permet d'analyser le contenu en mutation(s) des souches obtenues (en effet, à l'issue de la mutagenèse, il n'est pas rare qu'un mutant contiennent plusieurs mutations). Elle permet aussi de ranger les différentes mutations dans des locus (ou loci) sur les chromosomes et donc d'estimer le nombre de ces locus. Cette méthode fonctionne avec les allèles récessifs ou dominants.

Pour la mettre en œuvre, il faut croiser les mutants par la souche sauvage puis croiser les mutants entre eux et analyser la descendance. Ceci se réalise très bien chez les eucaryotes au moment de la reproduction sexuée, mais il existe d'autres méthodes (en particulier chez les procaryotes) qui ne mettent pas en jeu la reproduction sexuée.

 

 

Les procaryotes

 

Nous avons vu dans les rappels biologiques qu'il n'existe pas chez les bactéries de mécanismes similaires à la reproduction sexuée des eucaryotes. Cependant, il est possible d'établir des cartes en utilisant trois phénomènes, la conjugaison, la transformation et la transduction. De ces trois techniques, la transduction est la plus utilisée.

 

la conjugaison

Les bactéries peuvent contenir des plasmides conjugatifs (tels que le plasmide F chez E.coli). Ces plasmides conjugatifs ont permis le développement de systèmes de cartographie. En effet, ces plasmides ont la capacité de s'intégrer dans le chromosome bactérien par recombinaison :

Image77

 

Les souches ayant un plasmide intégré sont appelées Hfr (pour haute fréquence de recombinaison). Elles ont toutes les caractéristiques de bactéries F+ si ce n'est que lors du transfert de F vers une bactérie F-, ce transfert s'accompagne de celui de l'ADN du chromosome :

Image78

Après cette conjugaison, il se produit une recombinaison dans la bactérie F- entre l'ADN du chromosome et l'ADN nouvellement introduit :

Image79

Notez que le plus souvent après cette conjugaison la bactérie F- reste F-. Ce système a permis le développement d'un système de cartographie. En effet, si la bactérie donneuse Hfr diffère de la bactérie réceptrice par un certain nombre de marqueurs, il est possible de suivre l'apparition au cours du temps de ces marqueurs dans la bactérie réceptrice. Pour ceci il faut "croiser" une bactérie mâle avec une bactérie femelle et interrompre la conjugaison à différents moments (en agitant la culture !).

 

exemple:

Chez E. coli, une souche mâle Hfr azir tonr lac+ gal+ Strs est utilisée comme donneuse sur une souche réceptrice F- azis tons lac- gal- Strr. Str code pour une protéine ribosomale, les autres mutations sont localisées dans des gènes dont les produits codent des enzymes du métabolisme.

A différents temps après le mélange, les bactéries sont agitées et les bactéries Strr sont analysées pour la présence des marqueurs azir tonr lac+, et gal+ (la sélection des bactéries Strr, appelées exconjugants, permet de se débarrasser des cellules Hfr).

Les résultats suivants sont obtenus :

Image80

A partir de ceci, il est possible de déterminer l'ordre des marqueurs sur le chromosome:

Image81

 

Chez E. coli, l'insertion du plasmide F dans le chromosome peut se faire à différents endroits. Ceci permet de cartographier à partir de plusieurs origines. Les données obtenues montrent alors que les ordres obtenus pour les mêmes marqueurs diffèrent mais ne sont pas aléatoires. L'analyse de l'ensemble des résultats a permis de conclure qu'en fait le chromosome de E. coli est circulaire. Ce principe permet donc de cartographier des mutations nouvellement obtenues en se servant des mutants comme réceptrices et de souches Hfr sauvages comme donneuses.

 

II-la transformation

Le principe de la cartographie est le même que pour la transduction (cf. en dessous) avec la différence que l'introduction de l'ADN se fait par transformation plutôt que via un phage.

 

III-la transduction

Il existe plusieurs types de transduction en fonction du type de phage utilisé. La méthode la plus répandue car elle permet de cartographier n'importe quelle région du génome bactérien est la transduction généralisée qui se fait avec le phage P1. Le principe de la transduction est le suivant est le suivant :

transd

 

Vous voyez que le phage P1 peut emporter un fragment du génome bactérien de la bactérie donneuse et l'injecter à la bactérie receveuse. La fréquence de ce processus est très faible. Il faut donc pouvoir sélectionner facilement la bactérie transduite. Le principe de la cartographie est alors très simple. Si on part d'une souche donneuse a+ b+ et que l'on transduit une bactérie receptrice a- b- les bactéries "co-transduite" a+ bseront d'autant plus fréquente que les gènes a et b sont proches. Notez que pour que les gènes soient co-transduits, il faut qu'ils soient sur un fragment suffisamment petit pour qu'il puisse être emporté par le phage P1, soit espacés au maximum de 60 kb.

 

 

Les eucaryotes: la mitose

 

Nous avons vu dans le chapitre 1 qu'au cours d'une mitose, il ne se produit pas (en théorie !) de changements du matériel génétique; Chaque cellule fille recevant la même information de la cellule mère.

Il existe cependant quelques cas, où des changements se produisent et où ceux-ci peuvent être utilisés par les généticiens pour faire de la cartographie.

I-ségrégation des chromosomes nucléaires

Nous avons vu qu'il peut se produire des anomalies de ségrégation des chromosomes nucléaires comme la non-disjonction. Si ceci est le plus souvent létal chez les haploïdes, chez les diploïdes les cellules déficientes pour un chromosome ou avec un chromosome surnuméraire peuvent survivre. Ce type d'événements est en général très rare (mais il peut être provoqué par divers traitement, dont la colchicine).

exemple : chez un hétérozygote a/a+ (avec a récessif)

Image82

 

Dans le cas d'une colonie de levure, on voit apparaître un secteur mutant au sein d'une colonie sauvage :

Image83

 

Dans le cas d'un animal, on obtient ce que l'on appelle une mosaïque, c'est à dire un individu avec un mélange de cellules ayant des compositions génétiques différentes.

Chez les champignons haploïdes et plus particulièrement chez Aspergillus, il existe un cycle que l'on qualifie de cycle parasexuel. Chez Aspergillus, il est possible de sélectionner des noyaux diploïdes qui se produisent spontanément et qui se propage de manière assez stable surtout s'il existe une pression de sélection. Ceux-ci retournent cependant rapidement à l'état haploïde en absence de pression de sélection. Il en résulte des ré-associations aléatoires des chromosomes présents dans les souches utilisées initialement pour fabriquer le diploïde. Ceci permet de cartographier rapidement les gènes sur les différents chromosomes.

exemple:

Localisation sur le chromosome II d'un gène avec 2 allèles (m1 et m2). Le chromosome II porte w, un marqueur de coloration blanche des conidies (les conidies sauvages w+ sont vertes).

Pour la localisation, on construit dans un premier temps l'hétérocaryon, <m1, y, w+ > + <m2, y+, w> (y est un marqueur de coloration qui donne des conidies jaunes et qui n'est pas situé sur le chromosome II). L'hétérocaryon produit des conidies qui sont soit blanches soit jaunes (les conidies possèdent un seul noyau). Ensuite, on sélectionne facilement un diploïde qui a des conidies vertes (si les conidies sont vertes c'est que le noyau est diploïde et qu'il se produit de la complémentation entre les couples y/y+ et w/w+). Puis, on attend l'haploïdisation et on regarde le phénotype des souches qui ont des conidies blanches:

- Si toutes ces souches ont le phénotype apporté par m2, c'est que m1/m2 se trouve aussi sur le chromosome II.
-Si la moitié des souches ont le phénotype m1 et l'autre moitié le phénotype m2, alors m1/m2 ne se trouve pas sur le chromosome II.

On dispose chez Aspergillus de souches "plurimarquées" sur tous les chromosomes qui permettent en un seul croisement de cartographier les gènes sur un des 8 chromosomes.

Finalement, il se produit au cours de la mitose de rares crossing-over dit CO mitotiques (que l'on peut induire par des traitements appropriés !). On obtient dans ce cas, aussi des colonies sectorisées ou des mosaïques.

exemple :

Chez la drosophile, y (couleur jaune du corps) et Sn (soies courtes et courbes) sont situés sur le même chromosome. Que se passe-t-il si des COs mitotiques se produisent dans une mouche hétérozygote avec les allèles y et Sn associés en trans ?

Si le CO se produit entre le centromère et les deux gènes:

Image84

Dans le cas de droite, chaque cellule va donner naissance à un clone ce qui va aboutir à ce que l'on appelle des spots jumeaux :

Image85

Je vous invite à voir ce qui se passe avec un CO entre Sn et y

Je vous rappelle que de nombreux cancers sont provoqués à la suite de COs mitotiques (ou des non-disjonctions), en particulier chez certains sujets prédisposés. Par exemple, certains individus portent un allèle défectif du gène Rb à l'état hétérozygote. Ces individus montrent des prédispositions aux tumeurs oculaires (rétinoblastomes) car après des COs mitotiques, certaines de leurs cellules se retrouvent homozygotes pour l'allèle défectif qui intervient dans la prévention de la prolifération cellulaire des cellules de la rétine. Ces cellules s'engagent alors dans la voie qui après d'autres mutations (au moins deux chez l'homme) permettent de former une tumeur cancéreuse. Il en va de même pour le gène célèbre codant la protéine p53. On appelle ces gènes des gènes suppresseurs de tumeurs. Pour ces gènes, l'allèle sauvage est dominant et il faut inactiver les 2 copies du gène pour engager la tumeur. Je vous rappelle qu'un oncogène est la forme mutante d'un gène cellulaire (appelé proto-oncogène) qui entraîne la cancérisation. Dans ce cas, l'oncogène est dominant par rapport à la forme sauvage proto-oncogène.

II- ségrégation extrachromosomique

Nous n'avons pas encore parlé en détail de la transmission du matériel génétique extra chromosomique. Celui-ci ne possède probablement pas de système de répartition aussi efficace que les chromosomes nucléaires au moment de la mitose (on connaît très mal les modalités de répartitions des mitochondries et des chloroplastes). En fait dans une cellule, il existe plusieurs copies du génome mitochondrial (ou chloroplastique) qui le plus souvent est une molécule d'ADN circulaire. Ceux-ci se répartissent au hasard au moment de la division. En fait les mitochondries sont capables de fusionner et les recombinaisons entre molécules d'ADN mitochondrial sont très fréquentes et sont détectables aussi bien après la méiose que la mitose. Voyons ce qui se passe au moment de mitoses en prenant comme exemple la levure Saccharomyces cerevisiae.

Si on effectue un croisement entre une cellule haploïde sauvage et une cellule haploïde mutante qui porte un allèle mutant pour un gène mitochondrial, on obtient un diploïde qui contient les deux types d'ADN mitochondriaux, on dit que le diploïde est hétéroplasmique. Au cours des mitoses que va faire le diploïde, les ADN mitochondriaux vont entrer aléatoirement dans le bourgeon qui deviendra la cellule fille:

Image86

 

Certaines cellules retrouveront un état homoplasmique avec un seul type de mitochondrie. Chez la levure, ce processus est très efficace (sans que l'on sache pourquoi) et les cellules hétéroplasmiques disparaissent très rapidement de la culture. On constate donc une ségrégation des deux caractères au cours des mitoses. Ceci permet de différencier facilement des mutations affectant l'ADN mitochondrial (mutation rho- et mit-) de mutations affectant l'ADN nucléaire (mutation pet-). En effet, ces dernières ne ségrègent pas au cours de la mitose (aux rares COs et non-disjonction près).

Dans certains cas, un seul des deux types de molécules d'ADN mitochondrial est transmis. Chez l'homme la transmission préférentielle dans la lignée somatique de certaines molécules défectives d'ADN mitochondrial aboutit à des pathologies incluant des myopathies et des cécités.

Lorsqu'on possède des hétéroplasmons avec deux génomes mutants (dans des croisements mutant x mutant par exemple), alors ceux-ci peuvent recombiner (attention, n'oubliez pas que les mitochondries ne sont pas des structures statiques, elles fusionnent, se scindent etc., permettant ainsi la mise en présence des deux génomes). Nous voyons au chapitre 6 que cela empêche la réalisation des tests de complémentation basés sur la croissance des diploïdes.

 

Les eucaryotes: la méiose

 

Nous avons vu dans le chapitre 1 les aspects cytologiques de la méiose. Les différents cycles de reproduction permettent d'avoir accès à différents niveaux d'analyse (soit les résultats de la méiose, chez les haplobiontiques, soit le résultat des réassortiments des gamètes chez les diplobiontiques, soit les deux chez les haplodiplobiontiques).

 

I- ségrégation des chromosomes

Chez tous les organismes, on définit deux grands phénomènes de recombinaison génétique qui permettent de réassortir différents allèles.

Le premier phénomène provient de la ségrégation indépendante des chromosomes homologues et des chromatides au moment des deux divisions de la méiose, il s'agit du brassage chromosomique. Dans ses expériences Mendel n'a utilisé que des gènes localisés sur des chromosomes différents; ce qui l'a conduit à énoncer sa deuxième loi d'indépendance de ségrégations des caractères. Cependant, rapidement, on s'est aperçu que certains gènes ne ségrégeaient pas indépendamment les uns des autres (et donc que la deuxième loi de Mendel était fausse dans certains cas). Rapidement, il a été établi qu'ils se trouvaient sur les mêmes chromosomes et qu'ils pouvaient être dissociés par des évènement de recombinaison au sein d'un chromosome aux quels le nom de crossing-over (ou CO) a été donné.

La fréquence de ces COs peut servir à mesurer la distance entre deux régions de l'ADN située sur un même chromosome. En effet, plus ces régions sont éloignées, plus la fréquence des COs entre ces régions sera élevée.

Par convention, on définit 1 unité de distance génétique (que l'on mesure en centimorgan, cM) comme la distance entre deux régions pour lesquelles en moyenne 1 produit de la méiose sur 100 est recombiné. En d'autre terme, pour deux régions d'un même chromosome (chromatide) séparées de 1cM, il y a une chance sur cent que les deux régions se retrouvent sur 2 chromatides différentes après la méiose. Pour calculer les distances entre deux régions, il faut donc calculer le pourcentage de chromatides recombinées parmi la totalité des chromatides.

Mais, s'il se produit un deuxième CO entre les régions cela va entraîner un retour à une chromatide d'aspect parental.

Image87

Dans ces conditions, on voit que la distance sera sous-estimée car il faudrait compter deux fois les doubles COs alors que ceci ne seront seront comptés. Ce biais est de plus en plus important quand la distance entre les deux régions augmente. Deux approches sont possibles pour contourner ce problème. On peut essayer de cartographier à l'aide de marqueurs intermédiaires de façon à ne prendre en compte que des petites distances. On peut aussi extrapoler la distance en supposant que l'apparition des COs est aléatoire. Voyons comment procéder.

Lorsqu'il se produit plus d'un CO, la fréquence des produits de méiose recombinés que l'on peut détecter (RF) est de 50% du nombre réel quel que soit le nombre de CO :

Image89

D'après ce dessin, on voit donc que la fréquence des méioses qui n'ont pas subi de CO, c.a.d. F(X = 0), est reliée à la fréquence des recombinants car elle est égale à 1 - 2 x RF.

Or nous pouvons relier le nombre moyen de CO à la fréquence des produits de méiose sans CO car la loi d'apparition des CO suit une loi de Poisson si les crossing-over sont rares et indépendants les uns des autres (loi de probabilité des évènements rares). Les fréquences du nombre des COs sont donc données par la formule F(X = i)  = e-m mi/i!, où m est le nombre moyen de COs entre les deux régions et i le nombre de COs.

Cela veut dire que la proportion des méioses où il ne se produit pas de CO est F(X = 0) = e-m = 1 - 2 x RF

d'où l'on tire que m = - ln (1 - 2 x RF)

Nous voyons sur le schéma ci-dessus que pour 1 CO par méiose, il y a seulement la moitié des chromatides qui sont recombinées et donc la distance génétique est 1/2 m soit pour avoir la distance en cM :

d = - 1/2 ln (1- 2 x RF) X 100

exemple:

Si on trouve 38 % de chromatides recombinées à l'issue du croisement que l'on analyse, la vraie distance est probablement proche de - 0.5 x ln (1- 2x 0.38) = 0.71 soit 71 cM. Vous voyez donc que si on ne corrige pas la distance, on la sous-estime grandement.

Mais attention, ce calcul n'est valide que si les COs se produisent indépendamment les uns des autres. Ceci n'est pas le cas pour de nombreux organismes. De plus, nous allons voir que chez certains organismes, où l'analyse des produits de la méiose est possible, nous pouvons avoir accès aux doubles COs. Cette formule ne s'applique pas pour l'estimation à partir de la distance qui prend en compte déjà les doubles COs.

 

 

Le test 3-points

 

Dans le cas où plus de deux mutations sont en jeu dans les croisements, je vous conseille de les traiter deux à deux. Il est cependant un cas, celui dit du test trois points, où l'analyse des trois mutations ensembles permet de les ordonner sur les chromosomes.

exemple: dans un croisement d'une F1 hérérozygote par elle-même

Image910

 

La fréquence d'un double CO entre a et b et entre b et c est le produit de la fréquence d'un CO entre a et b avec celle d'un CO entre b et c. Elle est donc très inférieure à ces deux dernières fréquences. Dans les descendants les chromatides portant (a1 b2 c1) et (a2 b1 c2) sera la plus faible. En résumé, le gène qui recombine avec les deux autres avec la plus faible fréquence se trouve au milieu.

 

 

La ségrégation extrachromosomique

 

Chez la plupart des organismes, il existe une différence entre le gamète apporté par le mâle et celui apporté par la femelle. Le plus souvent, le cytoplasme est apporté uniquement par la femelle. Il s'ensuit dans ces organismes une ségrégation des mitochondries (et des chloroplastes) qui suit le plus souvent une hérédité strictement maternelle. Attention, il existe des exceptions. En particulier chez les moules les mitochondries peuvent être héritées du partenaire mâle ! Dans tous les cas, l'hérédité est dite non-mendélienne. Je vous rappelle que nous avons déjà vu une hérédité non-mendélienne dans le chapitre des polymorphismes avec le système het-s / het-s* de Podospora anserina.

Chez l'homme, il existe un certain nombre de maladies pour laquelle l'hérédité est strictement maternelle comme des myopathies et des surdités (nous avons déjà vu ceci pour la ségrégation préférentielle au cours des mitoses, de molécules anormales d'ADN mitochondrial chez des individus malades ; le plus souvent ces individus héritent ces molécules de leur mère). Nous avons aussi vu que cette hérédité strictement maternelle permet de retracer l'histoire de l'ADN mitochondrial (voir les haplotypes dans le paragraphe du polymorphisme) et par-là de retracer l'histoire des populations humaines. Voic d'autres exemples.

Chez certains champignons, nous avons vu qu'il existe une différenciation de gamètes mâles et femelles. Il est donc possible d'orienter des croisements. Chez Podospora anserina, il existe une souche résistante au chloramphénicol. Cette souche porte un allèle particulier (capR) du gène du grand ARN ribosomique mitochondrial codé par le génome mitochondrial. Il a été obtenu après une mutagenèse. L'allèle sauvage étant appelé capS. Il est possible (et techniquement facile) de croiser les souches de 2 façons, femelle capR x mâle capS ou femelle capS x mâle capR. Dans le premier cas, la descendance obtenue est entièrement capR dans le deuxième cas, elle est entièrement capS.

Chez la levure, les deux cellules contribuent équitablement au cytoplasme au cours de la reproduction sexuée. Après méiose, le cytoplasme est divisé en quatre, ce qui aboutit le plus souvent à une absence de ségrégation des caractères pendant la méiose. L'exemple le plus extrême et le cas d'un croisement d'une souche sauvage avec une souche dépourvue d'ADN mitochondrial incapable de respirer (dite souche rho°) :

Image101

 

Le diploïde peut respirer ainsi que les quatre spores issues de la méiose. La ségrégation est de type 4:0.

 

 

Le rapport carte génétique / carte physique

 

Nous avons vu que nous pouvons mesurer des distances génétiques entre les gènes. Ceci permet donc d'établir des cartes génétiques. La biologie moléculaire permet maintenant d'avoir accès à une distance physique qui peut se mesurer en nucléotide (ou paire de base) et donc d'établir des cartes physiques des chromosomes. Quelle est la relation entre distance génétique et distance physique ? Nous allons voir qu'en fonction des organismes la relation peut être très contrastée !

I- Chez la levure

L'estimation de la distance entre deux gènes contigus est de 1cM. Les gènes se répartissent grosso modo tous les 2 kb et donc chez la levure 1 cM ~ 2 kb. Ce rapport est relativement constant même si localement il existe des régions avec peu de COs (où 1 cM représente plus de 2 kb) et des "points chauds" (où 1 cM représente moins de 2 kb).

 

II- Chez la drosophile

Je vous rappelle que chez les mâles, les COs sont très rares ! Chez la femelle, on estime le rapport à environ 1 cM ~ 500 kb. Chacun des gros chromosomes subit donc environ 1CO par méiose.

 

III- Chez l'homme

L'estimation actuelle est de 1cM pour 1 Mb (= 106 pb). Ceci a pour conséquence que chaque chromosome subit entre 1 et 3 COs par méiose. Donc, chacun des chromosomes, que vous avez hérité de vos parents, est une mosaïque des chromosomes de vos grands-parents ! Vous êtes donc réellement génétiquement uniques, sauf si vous avez un vrai jumeau (et encore nous avons vu qu'il existe des événements génétiques somatiques par exemple !).

 

IV- Chez Podospora anserina

Chez ce champignon la carte génétique ne reflète pas la carte physique ! En effet, les crossing-over ne sont pas indépendants et il existe ce que l'on appelle des interférences, c'est à dire que la probabilité qui se passe un crossing-over supplémentaire sur un chromosome dépend de la préexistence d'autres COs. En l'occurrence chez Podospora, la présence d'un premier CO inhibe fortement d'un CO supplémentaire (interférence négative).

En particulier sur le chromosome I, il ne se produit qu'un seul CO entre le centromère et le gène du type sexuel mat. Sur ce chromosome, il existe d'autres gènes (AS4) qui co-ségrègent avec mat et qui présentent aussi des ségrégations distordues.

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En effet, le pourcentage de post-réduction de mat et AS4 est de 98 % !!

 

 

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