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Cours de Génétique

 

cours rédigé par M. Silar

 

Chapitre1: rappels

Chapitre2 : un peu d'histoire

Chapitre3 : la variation

Chapitre4 : quelques notions de Génomique

Chapitre5 : la mutagenèse

Chapitre6 : la complémentation

Chapitre7 : la recombinaison et l'établissement de cartes génétiques

Annexes : la ségrégation des gènes au cours des générations dans les différents organismes

Cours rédigé par Mme Gonzy

Chapitre 8 :les mécanismes de recombinaison

 

Chapitre9 : la réparation des dommages à l'ADN

 

Chapitre10 : les éléments mobiles

 

Chapitre 11: la réalisation du phénotype

 

Chapitre 12 : Les interactions géniques

 

 

LES MECANISMES DE RECOMBINAISON

INTRODUCTION


Dans son sens le plus large le recombinaison c’est la réorganisation du génome :
soit par réassortiment au hasard des chromosomes à la méiose,
soit plus spécifiquement par cassure et recollage des brins d’ADN.

La stabilité (constance ) du génome au cours des générations est assurée par différents mécanismes :

  • Fidélité de la réplication de l’ADN
  • Précision de la ségrégation des chromosomes en mitose et en méiose
  • Réparation des altérations de l’ADN au cours de la vie cellulaire.


La variation du génome est assurée par d’autres mécanismes :

  • Réassortiment d’allèles à la méiose et crossing-overs,
  • Mutations, réarrangements, transpositions, conversion génique.

La recombinaison génétique intervient dans de multiples évènements cellulaires et participe aussi bien à la constance qu’à la variabilité du génome.

Exemples :


1-
La recombinaison homologue est impliquée dans la réparation des dommages subis par l’ADN ; chez la levure c’est la principale stratégie de réparation des cassures double-brin.

2- la recombinaison est liée au déroulement de la méiose ; chez la levure l’appariement et la ségrégation des chromosomes au cours de la méiose dépendent de fonctions de recombinaison homologue.

3- elle participe au contrôle de l’expression de certains gènes qui dépend de réarrangements (donc de recombinaison) à un moment donné ; c’est le cas par exemple :

  • des gènes de type sexuel MATa et MATa chez la levure,
  • de la variation des antigènes de surface des trypanosomes africains,
  • de l’expression du répertoire des gènes d’immunoglobulines.

4- Chez certains organismes certaines étapes du développement sont associées à des réarrangements génomiques ; c’est le cas :

  • chez les Ciliés, où le processus de polyploïdisation lors de la formation du macronucleus (noyau végétatif par opposition au micronucleus ou noyau germinal) s’accompagne d’une fragmentation des chromosomes avec élimination de certains morceaux et réassociation des morceaux restants ;
  • chez l’ascaris, où on observe une diminution de la taille des chromosomes due à l’élimination de régions d’hétérochromatine.

5- chez la drosophile, l’amplification des gènes codant pour les ARN ribosomaux et les protéines du chorion s’accompagne de recombinaison ;

6- Des recombinaisons anormales peuvent conduire à des pathologies : c’est le cas du daltonisme ou de certaines déficiences du système immunitaire venant d’une incapacité des lymphocytes à réarranger correctement les gènes d’immunoglobulines.


Le daltonisme

Environ 1% des hommes sont aveugles pour le rouge et le vert, 2% sont aveugles au vert et 8% ont une mauvaise discrimination entre le rouge et le vert.
Trois gènes codent pour trois pigments photosensibles des cellules cônes, respectivement sensibles au bleu, au rouge et au vert. Le premier est codé sur un autosome mais les gènes des deux derniers sont codés sur le X, installés en tandem et homologues à 96%. Ils résultent de la duplication d’un gène ancestral, il y a 30 millions d’années. La portion de génome qui suit le gène a également été dupliquée.
Enfin il existe un polymorphisme sur le nombre de gènes de vision du vert : on en trouve un ou deux (voir ci-dessous).
Des crossing-overs inégaux peuvent se produire de deux façons :

  • Entre deux régions intragéniques (crossing-over en position 1), donnant naissance à une chromatide portant un gène composite : le spectre de sensibilité à la lumière de la protéine sera altéré.
  • Entre deux régions intergéniques (crossing-over en position 2), donnant naissance à une chromatide dépourvue de gène de sensibilité au vert qui entraine chez les garçons la cécité au vert et une autre chromatide munie de deux gènes de sensibilité au vert.


Variabilité des antigènes de surface des trypanosomes africains.

Ces parasites vivent dans le sang des humains et des bovins et causent la maladie du sommeil . Une partie de leur cycle vital a lieu dans la mouche tse-tse. Ils exposent à leur surface environ 1,5.107 molécules d’une glycoprotéine (appelée VSG pour variable surface glycoprotein) qui est la cible du système immunitaire. Environ 5 à 7 jours après l’infection par morsure de mouche, il y a remplacement de la totalité d’une VSG par une autre, prenant ainsi de cours le système immunitaire et rendant caduc l’immunoglobuline-anticorps dirigée contre la première VSG. Un pic de parasites nouveaux survient ainsi tous les 7 à 14 jours en moyenne. Au laboratoire, chez un lapin infecté on a pu ainsi obtenir plus de 100 changements différents de l’antigène de surface. On estime la variation de l’antigène à 10-4 par génération. A chaque changement, le nouveau variant résiste à la réponse immunitaire, donc se multiplie … etc.
Il existe dans le génome du trypanosome un réservoir d’environ un millier de gènes légèrement différents codant pour des VSG (soit 9% du génome) et répartis dans tout le génome. Un seul est exprimé à la fois. On a montré qu’un gène de VSG n’était exprimé que lorsqu’il se trouvait en position télomérique d’un chromosome. Au moment du changement il y a duplication d’un gène intérieur (donc le réservoir reste intact) et transposition de la copie qui s'insère dans un chromosome, en position télomérique dans un site d’expression. La précédente copie est détruite.


Les différentes sortes de recombinaison
Nous nous intéresserons à la recombinaison au sens étroit, celle qui implique des réarrangements moléculaires de séquence d’ADN avec cassure de brins et re-ligature.
On distinguera essentiellement :

1- La recombinaison homologue
Elle implique le transfert d’information génétique entre séquences homologues. Elle est à l’œuvre dans le crossing-over et dans ce cas on a un transfert réciproque entre deux chaines d’ADN (chromatides). Dans la conversion génique le transfert est unidirectionnel. On étudiera le mécanisme du crossing-over méiotique et on donnera quelques exemples de crossing-over mitotique.

2- La recombinaison site-spécifique
Elle se fait entre deux séquences reconnues par des enzymes spécifiques qui catalysent la coupure et la religature. Ces recombinases sont regroupées en deux familles : l’une comprend l’intégrase du phage l et la protéine FLP du plasmide 2m et l’autre regroupe les résolvases des procaryotes. On étudiera l’exemple de la recombinase FLP de levure.

 

 

LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE


En méiose, les chromosomes paternels et maternels qui viennent de se répliquer sont appariés sur la plaque métaphasique : au polymorphisme près leurs séquences sont identiques. A ce stade chaque chromosome a donné naissance à deux chromatides mais la région centromérique n'est pas encore répliquée. On peut avoir à ce moment des échanges de brins d’ADN entre une chromatide paternelle et une chromatide maternelle. La fréquence des crossing-overs (CO) est mesurée par le pourcentage de recombinants obtenus.
Chez l’humain on peut obtenir une trentaine de CO par méiose ; comme il y a 23 paires de chromosomes on peut donc observer des doubles CO.

Chez la sauterelle et grâce au microscope électronique on a pu voir les points de cassure et les échanges de brin. On marque les chromosomes à la bromo-déoxyuridine (BrDU) qui s’incorpore à la place de la déoxythimidine dans le brin nouvellement synthétisé. On observe les plaques métaphasiques dans la lignée germinale en révélant le BrDU par un colorant fluorescent; on observe alors des “ chromosomes arlequins ” qui présentent au niveau des chiasmas des structures en croix avec échange entre un brin sombre et un brin fluorescent.


Modèle de Holliday (1964)

Il permet d’expliquer le crossing-over et la conversion génique. Divers raffinements de ce modèle ont été proposés pour rendre compte de phénomènes de recombinaison très rares.
Etapes :

  • coupure par une endonucléase de deux brins de même polarité, appartenant à des chromatides différentes et à des positions homologues;
  • migration des extrémités 5’ libres à la recherche d’homologie sur le brin intact de l’autre chromatide et ligature ; il y a donc rupture de liaisons H et réassociation par hybridation avec migration du point de branchement ; rotation de l’un des chromosomes à 180°, les centromères s’écartent en donnant une structure en croix visible au microscope électronique ;
  • la résolution de la jonction se fait par deux nouvelles coupures de simples brins ; suivant la position de ces coupures on aura ou non échange de marqueurs flanquants. S’il y a coupure et raboutage des deux brins qui ont subi l’échange il n’y aura pas de CO visible, seul un très petit fragment est échangé, sur un seul brin. En revanche si les deux coupures ont lieu sur les deux brins qui n’ont pas subi l’échange, le CO se verra par échange des marqueurs flanquants.


La conversion génique.

Chez les champignons qui forment des tétrades ordonnées on peut observer, rarement, la ségrégation aberrante d’un couple d’allèle m/+. La répartition normale est de 2m/2+ s’il n’y a pas de CO entre le centromère et le gène, et de m/+/m/+ s’il y en a un. Mais on peut obtenir aussi, en très petit nombre, des tétrades ayant une répartition 3m/+ ou 3+/m : c’est ce qu’on appelle la conversion génique puisque dans ces asques un allèle sauvage s’est converti en allèle mutant ou inversement.
Le modèle de Holliday permet d’expliquer cette anomalie : si la mutation ponctuelle m se trouve entre le point de cassure initial et le point de résolution de la jonction, on a un misappariement au niveau de la mutation qui pourra être réparé en recopiant soit l’un, soit l’autre des deux brins.

 

 

MISE EN EVIDENCE DES GENES IMPLIQUES DANS LA RECOMBINAISON : LE SYSTEME RecA,B,C,D CHEZ E. coli

 

Dès 1965 on a supposé une corrélation entre les processus de recombinaison chez bactéries et virus et de réparation après irradiation. Ils semblent donner les mêmes produits intermédiaires et finals en particulier on a :
(1) dégradation des portions de simple brin des 2 parents non impliquées dans la réhybridation homologue ;
(2) polymérisation pour combler les portions de simple brin manquantes ;
(3) fermeture des liens phosphodiester à la frontière.
Des enzymes communs aux deux processus devaient donc être impliqués. Il semblait donc légitime de chercher des mutants affectés dans les 2 processus pour identifier les gènes nécessaires.
Phénotypes attendus pour ces mutants, isolés à partir d’une souche F-:

  • Incapacité (plus ou moins prononcée) de former des recombinants par conjugaison avec une souche Hfr, et
  • Incapacité de réparer l’ADN après irradiation aux UV donc grande sensibilité aux effets létaux de l’irradiation.



Protocole de récolte des mutants:

On mutagénise une souche : E. coli F- leu- ade+ lac- SmR (streptomycine résistante),
à la nitrosoguanidine (agent méthylant principalement la guanine en O6 qui s’apparie alors à la thymine donc provoque des transitions de G-C en A-T à la réplication suivante).
Les colonies survivantes sont étalées sur boite en milieu minimum (MM) supplémentée par la leucine. Cette boite est répliquée sur boite MM avec streptomycine, sans leucine ni adénine mais sur laquelle a été étalée en couche uniforme une souche Hfr leu+ ade- SmS (qui ne pousse donc pas).


Des recombinants leu+ ade+ poussent aux endroits où ont été superposées et où ont conjugué des cellules Hfr et F-.
On repère par comparaison avec la boite mère, les colonies F- qui n’ont pas donné de recombinants. Ces colonies sont reprises sur la boite mère, mises à pousser et testées pour leur morphologie (s’agit-il bien de coli ?) leurs auxotrophies (qui doivent être les mêmes que celles de la souche mutagénisée) et vérifiées pour leur incapacité à former des recombinants avec une souche Hfr.
On isole ainsi 2 mutants rec- parmi les 2000 testés.

Analyse plus fine du phénotype rec- :
Il pourrait s’agir simplement d’un défaut dans le contact entre les 2 cellules, qui entraine une absence ou une extrême fragilité du pont cytoplasmique entre la cellule F- et la cellule Hfr ; ou bien d’une destruction de l’ADN donneur avant de pouvoir recombiner.
Ceci est testé en faisant des mérodiploïdes, en croisant nos mutants avec une souche F+ portant un épisome F’lac+ : on obtient des colonies lac+, ce qui montre que l’ADN du donneur pénêtre bien dans la bactérie F-, mais ne peut pas recombiner.
Les deux mutants rec- sont testés pour leur sensibilité aux UV : après 10s d’UV 0,003% restent viables contre 40% chez la souche d’origine.

A partir des deux mutants on obtient plusieurs révertants UV résistants qui ont également récupéré leur capacité à conjuguer : c’est donc qu’une seule mutation provoque les 2 phénotypes.
Les 2 mutants ne complémentent pas entre eux donc ce sont deux allèles du même gène, recA.
Ces 2 allèles mutants, se caractérisent par un phénotype pléiotrope : une extrême sensibilité aux UV et aux altérations de l’ADN en général et une fréquence de recombinaison quasi indétectable. De plus ils ont une viabilité réduite (donnant une proportion importante, entre 20 et 40%, de cellules mortes) et sont incapables d’induire les prophages après dommage à l’ADN (pas d'entrée dans le cycle lytique des lysogènes).
Les mutations ont été cartographiées entre cysC et pheA.
L’expression de la protéine RecA a été étudiée : elle est induite par les UV ou autres dommages à l'’ADN par un facteur 100 fois. Cependant on trouve normalement de la protéine RecA dans une culture non induite: environ 1000 molécules par cellule en niveau de base.


Sélection d’autres mutants rec-

Grâce au test de Konrad, on crible de nouveaux mutants déficients dans la recombinaison, sans avoir besoin de passer par la conjugaison (test “ intrinsèque ”). On utilise une souche lac- contenant deux duplications de l’opéron lac en orientation inverse : l’une contient la délétion lacZ36, de la fin de lacZ et l’autre la délétion Bk1 du début de lacZ . Les deux délétions ne sont pas chevauchantes. On peut donc obtenir par recombinaison intrachromosomique des colonies lac+ : il y a reconstitution d’un gène lacZ complet avec inversion de la région entre les 2 duplications. On mutagénise cette souche et on teste sur les survivants la fréquence d’obtention de clones lac+.

Une mutation peut n’avoir aucun effet sur la fréquence, un effet hyperRec ou hypoRec. On sélectionne ainsi divers mutants, on les regroupe en groupes de complémentation et on cartographie les mutations. On définit ainsi de nouveaux gènes recB , recC, recD, recL. Notons qu’une mutation dans le gène codant pour la ligase est hypoRec tandis que PolA- est hyperRec car produit des extrémités libres non réparées ce qui stimule la recombinaison puisque celle-ci implique des coupures simple brin.

Souche E. coli

% survie après
30 sec UV

% recombinants

Nb de colonies lac+ (test de Konrad)

sauvage

4,1

100

100

recA13

4. 10-5

0,025

0

recB21

0,02

3

20

recC22

0,04

2

20

recL152

203

lig7ts

17

polA107

396


Les protéines impliquées


La protéine RecA
In vitro elle a plusieurs activités :

  • ATPase ADN dépendante
  • Echange de brin d’ADN, ATP dépendante
  • Formation de double brin
  • Répresseur d’hydrolyse du lien phosphodiester.

La protéine fait 38kD. Elle est douée de la propriété remarquable de trouver la séquence homologue à une séquence de 10 nucléotides parmi les 4,2.106 bp du génome de E. coli. De plus elle réunit les 2 séquences homologues de telle sorte que la séquence altérée (ou coupée) puisse être réparée en utilisant la séquence intacte comme matrice modèle. Comment ? En fait de nombreux monomères de la protéine RecA se fixent tout le long du simple brin dans le sens 5’ vers 3’avec l’aide de la protéine Ssb.
In vitro on peut mesurer l’activité de la protéine RecA en présence de l’ADN du phage M13 brin + marqué et de l’ADN double brin circulaire. La protéine se fixe tout le long du simple brin d’ADN en formant un filament, envahit le double brin correspondant, donc reconnaît l’homologie avec le simple brin qu’elle recouvre, au cœur du double brin et catalyse l’échange, en présence d’ATP. On obtient une “boucle-D ” et à la fin un double brin circulaire dont l’un des brins est marqué.


Le complexe protéique RecBCD est multifonctionnel :

  • Exonucléase ATP dépendante sur ADN simple et double brin
  • Endonucléase simple brin ATP dépendante
  • ATPase ADN dépendante (RecB)
  • ADN hélicase.

Le complexe a une forte affinité pour les extrémités d’ADN double brin libres. Il se déplace le long de la molécule en le déroulant (formation d’une bulle). RecBCD coupe le simple brin en présence d’ATP et Mg++, particulièrement au voisinage des sites “ chi ” (5’GCTGGTGG3’) qui sont des points chauds de recombinaison homologue s’ils sont approchés par le côté 3’ (sinon pas de coupure). La coupure a lieu le plus fréquemment 4 à 6 nucléotides avant le 3’ du site chi mais ceci dépend beaucoup de la concentration relative de Mg2+ et d’ATP.


Mécanisme

RecBCD agit en premier pour dérouler la double hélice et la protéine Ssb couvre le simple brin dégagé. Puis RecBCD coupe un des brins près d’un site chi. RecA se fixe sur le simple brin, conduit l’extrémité 5’ vers la chromatide homologue et déplace le brin de même polarité. Au même endroit il y a un site chi qui est coupé aussi, et le simple brin s’apparie avec la première chromatide. L’ADN ligase intervient pour sceller les brins : cela donne la structure de Holliday . Des protéines interviennent alors pour assurer la migration des branches : RuvAB (activité hélicase/ATPase) et donner la structure en croix. RuvA lie l’ADN sous forme de tétramère et RuvB de dimère. L’ensemble a une forte affinité pour les jonctions de Holliday, dissocie RecA de l’ADN et sert de moteur à la migration de la jonction. Pour résoudre la jonction une endonucléase, RuvC, coupe deux simple brins de même polarité au niveau d'un site de reconnaissance (A/T TT* G/C). Puis à nouveau, la ligase referme deux liens phospho-diester.

 

 

LA RECOMBINAISON MITOTIQUE


Elle se produit dans les cellules somatiques qui se divisent par mitose. Elle est beaucoup plus rare que la recombinaison méiotique : en effet à la mitose les chromosomes paternels et maternels ne sont pas appariés sur la plaque métaphasique; deux jeux complets de chromosomes paternels et maternels vont être répartis entre les deux cellules filles et non pas ségrégés comme à la méiose. Il est probable que les enzymes de recombinaison sont peu induits dans les cellules somatiques. Cependant, accidentellement, deux chromosomes homologues et déjà répliqués peuvent se trouver proches et s’apparier, au moins sur une petite longueur. Il peut alors se produire un crossing-over (CO) entre deux chromatides homologues.


Exemple du CO mitotique chez des souris hétérozygote cch/ca.

Elles sont de couleur gris clair alors que les homozygotes ca/ca sont blanches et les homozygotes cch/cch sont gris foncé : il y a codominance entre les deux allèles. En croisant des souris hétérozygotes entre elles on a obtenu parmi la progéniture gris clair (la moitié du total) une souris portant dans le pelage gris clair deux taches accolées de pelage blanc et gris foncé. Ces clones jumeaux sont la preuve qu’il y a eu recombinaison mitotique dans un mélanocyte (qui synthétise les pigments du poil) donnant naissance à deux cellules-filles de génotype différent. Chaque cellule-fille, par divisions successives, donne ensuite naissance à un clone de cellules qui lui sont identiques.


On estime la fréquence spontanée de la recombinaison mitotique à 10-5 par division. On voit donc que plus le nombre de cellules est grand et plus elles se divisent activement et plus des CO mitotiques ont des chances de se produire. Pour que le CO apparaisse phénotypiquement il faut :

  • qu’il ait eu lieu suffisamment tôt dans le développement pour que les clones soient suffisamment étendus pour être visibles ;
  • qu’il se produise dans une cellule du tissu où le gène s’exprime (dans un mélanocyte dans l’exemple ci-dessus).



Incidence de la recombinaison mitotique chez les mammifères.

Certaines tumeurs semblent associées à un CO mitotique, cela a été démontré pour le rétinoblastome, ou tumeur de la rétine. Sur 33 rétinoblastomes observés au cours d’une étude, 24 présentaient une perte de l’hétérozygotie pour le chromosome 13. Sur ce chromosome est situé le gène Rb qui intervient dans la différentiation cellulaire des cellules rétiniennes. Le génotype des malades était Rb+/Rb-. Une mutation récessive dans le gène Rb à l’état hétérozygote n’entraine aucun trouble. Cependant si dans une cellule de la rétine il se trouve que seul l’allèle Rb- est présent par perte de l’allèle sauvage, alors cette cellule va se diviser anarchiquement et donner naissance à une tumeur. Cette perte de l’allèle sauvage s’est produite par CO mitotique dans 4 cas sur les 24 susdits. Dans les autres cas elle est survenue par d’autres évènements : délétion d’une portion du chromosome 13 contenant l’allèle Rb+, perte du chromosome entier par non disjonction à la mitose précédente, cassure du chromosome 13, nouvelle mutation apparue de novo dans le gène Rb+.
D’autres tumeurs (rhabdomyosarcome, astrocytome) semblent dues également à un CO mitotique intervenant dans une cellule hétérozygote pour une mutation récessive dans un gène impliqué dans la prolifération et la différentiation cellulaire.


Utilisation de la recombinaison mitotique chez la drosophile.

Depuis longtemps les drosophilistes ont essayé d’augmenter la fréquence des CO mitotiques pour faire de l’analyse clonale. Cela peut se faire en irradiant les larves de mouches aux rayons X, mais plus récemment ont été mises au point des techniques génétiques qui permettent non seulement d’obtenir des clones mitotiques dans 90% des mouches mais aussi de cibler les CO mitotiques dans des tissus particuliers. Cette technique utilise les propriétés de la FLP recombinase spécifique de levure, qui reconnait un motif sur l’ADN appelé séquence FRT. Ces séquences FRT ont été introduites sur les 3 grands chromosomes de la drosophile : on peut donc avoir des échanges de portions de chromosomes à la demande, quand et où on induit l’expression de la recombinase FLP.
Notons que toute cette technique d’introduction de séquences étrangères sur les chromosomes de drosophile repose sur la transgénèse donc sur l’élément P.

Quelles informations peut donner l’analyse de clones mitotiques ?
Entre autres on peut:

  • Savoir si un gène a une expression autonome cellulaire ou non ;
  • Déterminer le lignage d’une cellule, c’est-à-dire la portion de territoire qui descend d’elle par divisions successives ;
  • Etudier l’expression d’un gène après son stade de létalité : en effet si une mutation dans un gène est létale pour l’organisme à un stade très précoce on ne pourra pas savoir, autrement que par analyse clonale, quel est son rôle ensuite c’est-à-dire quel sera le phénotype cellulaire chez le mutant à un stade plus tardif.
  • Savoir si un gène est requis au cours de l’ovogénèse.

 

LA RECOMBINAISON SITE-SPECIFIQUE


Elle se fait grâce à un couple comprenant une recombinase et son site de reconnaissance sur l’ADN au niveau duquel elle coupe. Il en existe plusieurs exemples dont certains sont mis à profit en génétique moléculaire pour faire de la recombinaison dirigée :

  • Recombinase Cre et site loxP du phage P1 : utilisés pour faire de la recombinaison dirigée chez la souris;
  • Intégrase Int et site xis pour l’insertion du prophage l dans le chromosome de coli ;
  • Recombinase FLP du plasmide 2m de levure et site FRT : recombinaison dirigée chez la drosophile.



Le système FLP/FRT.

La recombinase FLP (pour Flip-flop) est codée par le plasmide 2m de la levure S. cerevisiae, plasmide nucléaire à haut nombre de copies (50-100). Le plasmide code également pour trois autres gènes nécessaires à sa réplication, mais non nécessaires à la recombinaison FLP-dépendante. Sur le plasmide on trouve deux séquences-cibles reconnues par la recombinase, longues de 34bp, situées en orientation inverse, qu’on appelle séquences FRT (pour FLP recognition target). La recombinaison entre ces deux sites provoque l’inversion d’une portion du plasmide par rapport à l’autre : on a donc deux isomères plasmidiques. L’intérêt biologique de cette inversion est de produire de multiples copies de plasmide à partir d’un seul site d’initiation de la réplication, en inversant le sens de migration de la fourche de réplication.

Mécanisme de recombinaison.
Chaque séquence cible se compose de deux régions inversées répétées (IR) de 13bp séparées par 8bp. Une molécule de FLP se fixe sur chaque IR, de telle sorte que 4 monomères sont fixés sur les deux séquences cibles au moment de l’échange : chaque molécule de FLP s’occupe d’un brin. Il y a coupure des deux brins de même polarité sur chacun des deux sites, fixation covalente transitoire de la FLP sur le site opposé, par un résidu tyrosine, sur l’extrémité 5’ libre de chaque brin, puis ligation en échangeant les brins. La structure de Holliday est résolue par coupure et réunion des deux autres brins grâce aux deux autres molécules de FLP, de la même manière.



Application : recombinaison mitotique chez la drosophile.

L’intérêt de la recombinaison mitotique est de produire des clones de cellules homozygotes pour une mutation dans un gène donné. Cette technique a permis des avancées considérables dans l’étude du développement de la drosophile. On peut ainsi:

  • déterminer le lignage cellulaire, c’est-à-dire le nombre et la destinée des cellules issues d’une cellule d’origine par divisions mitotiques successives ;
  • étudier le phénotype cellulaire donné par une mutation qui entraine la létalité au niveau de l’organisme, après le stade de létalité (donc permet de savoir si un gène est requis plusieurs fois au cours du développement et quelle est sa fonction) ;
  • savoir si un gène a une expression autonome cellulaire ou non ;
  • déterminer le moment ou un gène cesse d’être actif ;
  • savoir si un gène est requis au cours de l’ovogénèse.


Par transgénèse (voir cours du second semestre sur l'élément P) des sites FRT ont été introduits sur les trois grands chromosomes le plus près possible des centromères. Dans les constructions les plus récentes le chromosome qui porte le site FRT contient aussi un marqueur qui va permettre de repérer facilement les frontières du clone mitotique : par exemple grâce à un site antigénique reconnaissable par un anticorps commercial.
Il faut ensuite introduire par simple recombinaison méiotique la mutation d’intérêt sur un des chromosomes FRT homologue (plus la distance est grande entre la position du gène et le site FRT et plus c’est facile).
Il faut enfin apporter par croisement un chromosome portant le gène de la FLP recombinase gouverné par un promoteur inductible adéquat (par exemple inductible par un choc thermique), éventuellement spécifique d’un tissu déterminé.
Après recombinaison mitotique induite, on repère les clones jumeaux grâce à l’intensité du marquage par l’anticorps : 0 ou 2 doses d’antigène dans les clones jumeaux et 1 dose dans le reste de l’animal qui est hétérozygote. Un des clones jumeaux est en même temps homozygote mutant pour la mutation d’intérêt et on peut repérer dans ce clone le phénotype produit par la mutation.
La figure ci-dessous décrit le mécanisme d’une telle expérience.

 

 

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